在20世纪90年代,感染性疾病致死者占全球死亡人数的三分之一,其中呼吸道感染居各类感染之首 。虽然历经多年,临床工作者不断努力,其死亡率仍居高不下,主要原因是没有获得及时正确的诊断和治疗。

    临床上将正常人喉以上部位称之为上呼吸道,上呼吸道定植大量的正常菌群,而气管以下包括气管、支气管和肺泡称下呼吸道,通常无菌。下呼吸道感染包括急性气管-支气管炎、慢性支气管炎急性发作、支气管扩张继发感染及肺实质感染(肺炎、肺脓肿)等。病原体有细菌、病毒、衣原体、支原体、真菌、立克次体和原虫等。

下呼吸道感染患者可有发热、咳嗽和咳痰,痰呈脓性、粘稠或血性,可伴有胸痛、气急,肺部可闻及湿罗音、白细胞总数及嗜中性粒细胞比例明显增高,X线检查提示肺部有炎症性浸润或胸腔积液等体症,严重时可导致感染性休克和呼吸衰竭,因此临床诊断一般不难;细菌学检验能明确感染病原及药敏结果,有助于疾病治疗、流行病学调查和医院感染的监测。

通常,仅需门诊治疗且无基础疾病的轻症社区获得性肺炎不必做病原学检查,因为:50%~90%病原体不能检出,而且经验性抗菌治疗效果好,死亡率低<1%~5%;但社区获得性肺炎需要住 ICU患者门诊患者抗生素治疗无效者、胸片检查见空洞性阴影者、白细胞减少者、酗酒者、慢性严重肝脏疾病者、严重阻塞性/结构性肺疾病患者、无脾(解剖性或功能性)者、近期旅行(2周内)者均应做病原学检查。目前医院内感染患者明显增多、病原谱复杂化多样化、耐药菌株产生和传播(和社会人口老龄化、免疫损害宿主增加、病原体自身演变等因素有关)均导致临床经验性用药困难、治疗失败增加,从而突显病原学诊断的重要,因而所有患者都必须行病原学检查。

而在病原学诊断过程中,诸多因素影响了其准确性和可靠性如采样技术、标本运输、实验室操作、仪器设备受限等,其中采样技术是首要的、普遍的因素,如果不加以合理选择、严格规范化操作,一定程度上会增加假阴性率、延误病情,最终增加患者死亡率。

近年来,临床工作者在不断探索新的、简便易行的病原学诊断采样方法,同时对一些传统的诊断方法也有了新的认识,本文对此作一概述。

 

一、痰涂片革兰染色(Sputum Gram's Stain , SGS
        
痰涂片革兰染色是鉴别革兰阳性菌和阴性菌最简单、快速、廉价的传统方法。

采样注意:尽可能在使用抗生素之前采集标本并在2小时内送检;以晨痰为宜,取标本前应摘去假牙,清洁口腔如刷牙和漱口;深咳,采集标本过程中最好有医务人员指导;无痰者可用3%~5NaCl 5ml吸入约5min诱导痰Bandyopadhyay等证实痰液诱导在无痰患者中是一种有效的采样方法;也可用物理疗法、体位引流、鼻导管抽吸等法取痰合格的痰标本判定标准为低倍视野下鳞状上皮细胞小于10个,白细胞大于25。如果不合乎此标准考虑为非下呼吸道标本,应该弃去重新采集。

近年来,有人对痰涂片革兰染色的作用提出异议。有学者认为在轻中度社区获得性肺炎中痰涂片革兰染色不能发现病原体,诊断价值不大,而且存在部分患者不能提供合格的痰标本,非典型病原体痰涂片革兰染色不能看到,阳性结果的判定各家不统一等缺点。但也有人认为痰涂片革兰染色和痰培养的符合率达90%,若痰涂片革兰染色见到典型的细菌,即使培养为阴性,仍有参考价值。反之,若培养阳性而痰涂片革兰染色阴性,则大多为定植菌或污染菌。

尽管意见不一,痰涂片革兰染色对治疗仍有一定的指导意义,临床主张患者入院后或者治疗前应该尽早留取痰液做痰涂片革兰染色,其意义在于:增加了初始经验性治疗对不太常见病原体的覆盖,如金黄色葡萄球菌或革兰阴性菌,这一点是最重要的,因为它将减少不合理的抗生素应用;还有,对后来的痰培养结果进行验证

 

二、痰培养(Sputum Culture, SC
       
取痰液标本时注意事项同痰涂片革兰染色检查,痰置于无菌容器中送检。对于细菌性肺炎,痰标本送检每天1次,连续23天;不建议24小时内多次采集,除非痰液外观性状出现改变;怀疑真菌或分枝杆菌感染者,应连续收集3天清晨痰液送检;标本采集后12小时内必须立即进行实验室处理。如果不能及时运送接种时,应暂存于4。合格的痰液标本判定标准同痰涂片革兰染色检查,合格的痰标本培养结果才有意义。

由于口咽部有细菌定植,痰培养出来的细菌不一定是致病菌。如连续2次以上分离到同一细菌也认为是感染菌;痰培养结果与胸水或血培养结果一致时,则可肯定患者为该菌的感染。定量培养能鉴别污染菌和感染菌,一般痰液定量培养菌落计数≥107 CFU/ml(集落生成单位/毫升)的纯培养,或者在任一培养基菌落计数≥108CFUml(厌氧菌≥109CFUml),再或者优势菌落计数大于唾液同种细菌一百倍时可视为该菌感染,但痰定量培养普通实验室很难开展,因此常采用半定量培养法,即标准4区划线接种法接种(1-4-14区细菌生长结果以1+2+3+4+表示。

痰培养阳性率大约在25%50%之间,Hayon等认为痰液的连续微生物培养对指导肺部感染的治疗意义不大,即使痰培养见到某一优势菌也不能除外混合感染的可能;非典型病原体引起的感染中,常规痰培养只能发现一些正常菌群。尽管如此,培养结果对于某个具体患者的临床治疗来说还是有重要作用,同时从流行病学角度来说也是非常重要的,包括基于痰培养阳性患者的抗生素的敏感性数据用于制定指南。军团菌流行地区和近期有旅游史的重症病人,除了常规检查外,将呼吸道分泌物在特殊的缓冲木炭酵母浸膏琼脂上进行培养,以分离军团菌属的病原,对诊断和治疗也是有帮助的。

 

、气管吸引物(Endotracheal Aspiration, EA

操作步骤:听诊痰液积聚的部位,必要时予以体位引流及拍背,洗手,戴无菌手套,打开无菌集痰器的包装,连接负压吸引装置,将无菌集痰器之吸痰管以无菌蒸馏水润湿,将吸痰管插入气管插管或气切管,抽取适量痰液入集痰瓶中,将无菌集痰器上的吸痰管连同盖子取下,将集痰瓶底部的盖子取下盖在瓶口,若有需要则予100%氧气通气2分钟。注意:吸痰时手法要轻柔、吸痰时间≤15秒、将吸痰管送入气管插管深部拔出时再给负压、边旋转边退出。

标本采用106的阈值,诊断肺炎的敏感度平均76±9%,特异度75±28%。是置入人工气道的患者经常采取的临床方法,但标本易污染,可靠性稍差,半定量培养的方法不能作为确诊肺炎和决定抗生素治疗的可靠方法。需要结合临床具体分析。

四、经支气管镜的保护性毛刷技术(Bronchoscopy and Protected Specimen Brush, BS-PSB    

经支气管镜于下呼吸道取样时,易被杂菌污染,影响结果。导致下呼吸道取样标本受污染的因素很多主要包括以下3(1)支气管镜通过咽喉部及气管时易被杂菌污染。(2)支气管镜吸引时可导致上呼吸道分泌物污染支气管镜活检孔道。(3)注入利多卡因也可污染下呼吸道。上述因素均可影响标本培养的结果,因此便产生了将取样毛刷放置在带塞的导管中,再放入下呼吸道取样的保护性毛刷技术。

带塞导管远端的堵塞物一般常见的有3种:明胶(Glatin)明胶海绵(Gelfoam)聚乙二醇(Polyethlene Glycol);明胶易溶化防污效果不佳,明胶海绵则有时在肺部不易被吸收而聚乙二醇防污效果好且易于被肺部吸收。1979, Wimberley首先应用顶端带有聚乙二醇堵塞的双层套管防污效果甚佳,体外试验表明防污染率达100%。通过毛刷采集病变部位周围气道标本分泌物量约为0.010.001ml,毛刷再被稀释于1ml的生理盐水中,则稀释度为1001000以每毫升菌落形成单位≥103作为诊断肺部感染的阈值,保护性毛刷定量培养≥103 CFU/ml的分离菌是病原菌,<103 CFU/ml者为污染菌保护性毛刷敏感性达66±19%特异性90±15%,其特异性优于敏感性,是目前国际公认且被广泛使用的采样方法。我国1990年全国肺部感染会议已将其列为院内支气管-肺感染的病原学诊断方法。

Heyland等将肺部感染病人分为不接受支气管镜检查和接受支气管镜保护性毛刷肺泡灌洗两组,发现前者的抗生素使用量和死亡率均高于后者,充分证实了其重要意义。我科对200410—200612收住我院呼吸科和神经内科监护室57例重症肺炎并行气管插管机械通气的患者的研究显示。在重症肺炎机械通气的患者中,经人工气道,在支气管镜引导下,行单套管保护性毛刷检查采集下呼吸道标本的操作前后,患者的心率、血压、呼吸频率、血氧饱和度没有显著改变(P<0.05)。而且其敏感性为97.73%、特异性84.62%,根据药敏回报及时调整抗感染治疗方案,52例患者达到痊愈或显效的标准,占91.23%。即经支气管镜以单套管保护性毛刷取样结合细菌定量培养技术,在重症肺炎行机械通气的患者中应用安全性高,并能根据细菌培养及药敏回报调整抗感染药物可获得较高的治愈率,对临床目标抗感染治疗具有很强的指导意义。其前提是操作者要有丰富的临床经验以及熟练的操作技巧而且操作过程中严密监测患者生命征变化。

具体操作:将无菌保护性毛刷套管远端开口用聚乙二醇(分子量4000的聚乙二醇,其熔点为37℃,落在气道内可以迅速融化,并随咳嗽排出体外)栓塞,支气管镜经声门——气管或者人工气道到达X线胸片显示浸润病灶最明显或有脓性分泌物的区域,保护性毛刷经支气管镜吸引孔进入并伸出支气管镜末端1~2cm后再推出内套管,顶掉保护性毛刷末端的保护塞,保护塞丢弃到采样区域以外,内套管再伸出2cm,毛刷采集标本,采样后将毛刷缩回到内套管中,内套管再缩回到外套管中,将整体从支气管镜中拔出。75%酒精消毒套管末端,然后用无菌剪刀剪去毛刷以前部分套管,充分震荡使标本在1ml无菌溶液中均匀分布,然后送实验室进行微生物培养,如图1-4-2与图1-4-3所示。

注意事项:采样前尽量不作吸引,以保证采样足够;不要在活检孔中追加麻药(一般为2%的利多卡因),因为麻药会抑制培养过程中某些细菌生长;采样前48小时内尽量不用抗生素避免假阴性增加。Prats研究显示:对35呼吸机相关性肺炎患者在应用抗生素治疗前及开始治疗后的12244872小时分别以保护性毛刷采样,在应用有效的抗生素治疗后12小时内,即可见微生物种群的数量、其各自的浓度及保护性毛刷阳性百分比均出现迅速且显著的下降。某些类别的细菌(肺炎链球菌、流感嗜血杆菌)比其它菌种(金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌)更易受到抗生素的影响。

保护性毛刷技术也有其局限性,应充分给予认识:(1)保护性毛刷所获得的标本量仅为0.010.001ml,因此需要很精确的标本处理技术,这也是保护性毛刷肺泡灌洗敏感性低的原因。(2)对已接受抗生素治疗的病人其敏感度及特异性还可能降低有些文献报道可低至40%(3)保护性毛刷可能会增加出血及气胸的机会。(4)保护性毛刷毕竟为一种有创检查,部分患者不能耐受支气管镜而导致取样困难。(5)毛刷一次性使用,成本过高。(6)10%40% 病例有假阳性和假阴性

故应用此项技术时应该斟酌利弊,建议采用此方法的适应症:免疫缺陷病人的肺部感染;呼吸机相关性肺炎;难治性或延迟吸收的肺炎;怀疑有厌氧菌感染可能;疑有阻塞因素存在;有下呼吸道感染而痰液引流不畅;非侵入性检查结果阴性或难以解释;肺部感染与非感染性疾病的鉴别。

、经支气管镜的支气管肺泡灌洗技术(Bronchoscopy and Bronchoalveolar LavageBS-BAL

1987ThorpeKahn等首先采用支气管肺泡灌洗技术,灌洗液可达远端肺实质,采样范围广,敏感性达73±18%,特异性82±19%,是诊断下呼吸道感染的有效方法同时可能会减少出血及气胸等并发症的发生。对免疫受损或免疫功能受抑制者的机会感染如肺孢子虫、分支杆菌、巨细胞病毒感染及军团菌感染等,支气管肺泡灌洗检查均有很大诊断意义。

支气管肺泡灌洗的方法:通常在右中叶或左舌叶,生理盐水,一般为37,室温下(25左右)生理盐水亦可应用。支气管镜楔入肺段或亚段支气管,每次灌入25~50ml,总量100~250ml,不应超过300ml。负压吸引压力约为25~100mmHg,要防止负压过大过猛。支气管肺泡灌洗可收集较大范围肺实质(520百万个肺泡)的肺泡表面衬液标本。回收量:中叶或舌叶灌洗回收量应在40%以上,下叶或其他肺叶为30%以上。灌洗液吸入内壁涂硅的容器或其他防止巨噬细胞贴壁的容器中,周围宜被冰水(-4)包围,在半小时内送至实验室,通常在2~3小时内处理。确定肺部感染的阈值定为104 CFU/ml对于检验前应用过抗生素的患者应采用较通常低10倍的阈值作为标准。

然而支气管肺泡灌洗检查由于受近端气道分泌物的污染使其诊断的特异性降低。有一系列不同的控制标准来减少这种污染的影响检查支气管肺泡灌洗液中鳞状上皮细胞应该≤1%;或者支气管肺泡灌洗液中吞噬微生物的白细胞>7%,否则表明灌洗液被咽喉部细菌严重污染。在以上标准的控制下, 支气管肺泡灌洗技术对肺部感染病原学诊断的敏感性及特异性可达70%90%之间。为避免或减少支气管肺泡灌洗液被咽喉部分泌物污染1991Meduri采用一种保护性的支气管肺泡灌洗技术,即应用远端插入导管进行支气管肺泡灌洗。可用一根消毒的聚乙烯导管远端用聚乙二醇封堵经支气管镜活检孔道插入病变处灌洗液量一般为1020ml此种方法可有效地降低上呼吸道分泌物对灌洗液的污染,提高诊断的特异性。但在操作时有几点需要注意由于灌洗液量仅1020ml因此可能未进入肺泡或进入肺泡的少量液体难于回收,因此这种灌洗液只是支气管灌洗液;插入导管的深度以遇到阻力时为准;20ml的盐水应在1015s内灌入然后立即吸引;吸引时务必回撤导管12cm防止吸住支气管粘膜。回收液量一般在48ml之间;盐水注入速度不能过慢否则20ml液体将全部被外周气道吸收因而难于回收。必要时可行第2次灌洗;盐水注射速度也不能过快否则会造成反流,也会造成标本污染和回吸收量减少。吸引也不能过度导管撤出过程中更应禁止吸引。上述操作的不当可导致上呼吸道分泌物的污染。有的导管前端带有气囊可防止灌洗液的反流因而灌洗液量可适当增多也有作者应用废弃的Swan-Ganz导管做灌洗亦取得比较满意效果。

支气管肺泡灌洗检查的不足之处有支气管肺泡灌洗灌入液量与回收液量不衡定对半定量细菌培养结果可能产生影响;与保护性毛刷相比虽然发生出血及气胸等并发症的机率减少,但却可能加重缺氧及对心肺功能造成影响。

很多研究比较了保护性毛刷支气管肺泡灌洗两种方法在肺部感染时病原学的诊断价值关于哪种方法更好目前尚无一致的结论。保护性毛刷支气管肺泡灌洗在细菌定量培养方面的诊断价值难分上下,但在对病原快速诊断方面,保护性毛刷的敏感性不如支气管肺泡灌洗技术支气管肺泡灌洗的灌洗液经离心后涂片革兰染色所得的病原学结果与细菌培养的结果有很好的相关性因而可以提前预测病原的性质为抗生素选择提供大致的依据。Nys等发现支气管肺泡灌洗液中内毒素水平和细菌定量培养数量显著相关,通过检测灌洗液中内毒素水平可指导治疗。Flanagan等建议使用支气管肺泡灌洗液的革兰染色,若发现细胞内细菌,可以诊断肺炎,研究表明其特异性达90%Veber等检测支气管肺泡灌洗液中的被感染细胞(Infected Cells, IC),以3%作为阈值,其敏感性和特异性分别为74%96%Jaeger等通过比较保护性毛刷支气管肺泡灌洗液的定量培养和被感染细胞数量,发现支气管肺泡灌洗液的定量培养和检测被感染细胞数量对抗生素的耐受性更好。因此,患者已使用抗生素时建议采用支气管肺泡灌洗技术

在临床上尽快地得到病原学结果是非常重要的因其可以指导抗生素的治疗,降低患者死亡率,所以目前认为,保护性毛刷和支气管肺泡灌洗两者联合应用可以互补,较单独使用效果更好,二者联合敏感性增至88%特异性保持100%

总之,下呼吸道感染病原诊断的每种取材方法各有其诊断优势和缺点,方法选择可根据临床经验、设备条件、病人状况等具体情况。支气管镜对下呼吸道感染的诊断在不同临床条件不同病原体感染其意义是不同的。对社区获得性肺炎由于保护性毛刷支气管肺泡灌洗是一种侵入性检查单纯的支气管肺泡灌洗还易受到咽喉部分泌物的污染因此不主张常规使用。主要用于ICU病房的重症患者或经抗生素治疗未获改善的病人以便得到肯定的病原学诊断以使用敏感有效的抗菌药物。对医院内下呼吸道感染特别长期住院的危重病人和免疫功能受损的病人下呼吸道感染,保护性毛刷支气管肺泡灌洗检查对及时发现病原体是很必要的。支气管肺泡灌洗对诊断免疫功能受损、免疫功能低下患者合并机会感染有特殊意义。爱滋病(AIDS)合并肺孢子虫感染者支气管肺泡灌洗诊断阳性率可达80%对巨细胞病毒感染也有较大诊断价值敏感性为96%特异性达100%。在机械通气肺部感染患者(VAP)由于感染发生率高病情危重常是病人死亡的重要原因对这些病人,应用经气管镜保护性毛刷或者支气管肺泡灌洗技术尽快确定病原菌合理应用抗菌药物对提高病人的生存率至关重要。通过单一或者多种联合的方法明确下呼吸道感染的病原体对于指导抗生素使用,减少病原体产生耐药性和药物的副作用,缩短病程,降低费用具有重要意义。

  ( 郭 伟 )

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                节选于 人民卫生出版社《介入性呼吸内镜技术》,张杰主编(2012年11月)

保护性毛刷(PSB)及保护性灌洗技术(PBAL)

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