【摘要】  目的 观察紫杉醇对人胚肺成纤维细胞增殖的影响,推测其在抑制气道支架植入后肉芽组织增生方面的作用。方法 采用噻唑兰(MTT)法测定4.5ug/ml、13.5ug/ml、45ug/ml的紫杉醇作用24h、48h、72h后对人胚肺成纤维细胞增殖的抑制率。结果 4.5ug/ml组、13.5ug/ml组、45ug/ml组作用24h的抑制率分别为43.68%、58.84%、68.05%;作用48h的抑制率分别为75.54%、77.71%、91.88%;作用72h的抑制率分别为95.13%、97.11%、97.02%。结论 紫杉醇对人呼吸系统来源的成纤维细胞——人胚肺成纤维细胞(Human Pulmonary Fibroblast, HPF)有明显的抑制作用,在一定程度上呈现剂量时间依赖性,其在抑制气道支架植入后肉芽组织增生方面可能具有潜在价值。 

       气道支架植入技术是治疗气道狭窄,尤其是中心气道狭窄的重要手段之一。但气道支架植入过程中对气道粘膜的损伤和支架本身作为异物刺激而导致的肉芽组织增生及其引发的管腔再狭窄,严重影响了支架植入后临床疗效。与之类似,冠脉支架植入后的再狭窄也曾经是一大难题,但紫杉醇等冠脉涂层支架的诞生,极大地提高早期治疗效果并降低再狭窄的风险。鉴于紫杉醇冠脉涂层支架在心血管领域做出的巨大贡献,研制类似的气道药物涂层支架,来抑制气道支架植入后肉芽组织的增生,是解决气道支架植入后再狭窄的一个思路,而涂层药物的选择是首先需要解决的问题。

       成纤维细胞及毛细血管是肉芽组织的主要组成成分,本试验选取人胚肺来源的成纤维细胞,观察紫杉醇对其增殖的影响,探讨紫杉醇作为气道涂层支架备选药物的可行性。

一、材料和方法

 1  主要试剂及药物

       DMEM高糖培养液(中国医学科学院基础医学细胞中心),胎牛血清(Front BioMedicals,USA),0.25%胰蛋白酶-EDTA(北京天润善达生物科技有限公司),噻唑兰(MTT,sigma分装,北京鼎国生物技术有限责任公司),二甲基亚砜(DMSO,C2H6OS,Applichem,German),紫杉醇注射液(5ml:30mg,北京华素制药股份有限公司)。

 2  细胞与培养条件

       人胚肺成纤维细胞(CCC-HPF,中国医学科学院基础医学细胞中心)。10%新生牛血清的DMEM高糖培养液,5% CO2、37°C培养箱内培养。

 3  MTT法测定细胞生长抑制率

       将处于对数生长期的人胚肺成纤维细胞用0.25%的胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液,调整细胞密度为5×104个/ml接种于96孔板,每孔100ul。接种细胞分为5排,分别为空白对照组(不含细胞的培养液),细胞对照组(含单细胞的培养液),药物处理组(浓度梯度为4.5ug/ml、13.5ug/ml、45ug/ml),每排12个孔;边缘孔用HANKS液填充。其中各个梯度的药物处理组又分为3组,分别为24 h组、48 h组、72 h组,每组4个复孔。药物处理组的终浓度根据紫杉醇血峰浓度(Plasma peak concentration,PPC)1来做参考,分别检测1PPC,3PPC和10PPC的紫杉醇对人胚肺成纤维细胞的抑制作用。紫杉醇原液浓度6mg/ml,稀释浓度为1mg/ml。将96孔培养板置于37°C、5%培养箱内培养24小时,待细胞贴壁,分别在距培养结束72h、48h、24h时在对应的药物处理组分别加入0.9ul、2.7ul、9ul紫杉醇稀释溶液,再分别补充9.1ul、97.3ul、91ul培养液至每孔200ul液体。培养结束时加入5mg/ml的MTT20ul,继续孵育4h后小心吸去孔内培养液,加入DMSO150ul,置于低速摇床上振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶标仪上测定492nm的OD值,根据公式:抑制率=1-(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)。

 4  统计学处理

       采用SPSS 12.0软件进行分析,计量资料以±s表示。各实验组与对照组之间样本均数比较采用单因素方差分析,同一浓度实验组不同时间之间样本均数比较采用配对t检验。以P<0.05为有统计学意义,P<0.01为有明显统计学意义。

二、结果

 1  不同浓度紫杉醇作用不同时间后,96孔板内MTT反应镜下观

       对照组成纤维细胞接种与96孔板后生长良好,72小时后几乎铺满孔底;实验组成纤维细胞接种后随药物浓度及作用时间不同而生长状态不同,4.5ug/ml 24h组成纤维细胞增殖程度较对照组下降,但细胞仍基本保持正常形态;13.5ug/ml和45ug/ml 24h组细胞除增殖程度下降外,较多细胞变圆,活性已明显下降。4.5ug/ml 48h组和72h组较同浓度24h组增殖程度更低,但仍可见正常形态的成纤维细胞;13.5ug/ml和45ug/ml的48h组和72h组中大部分细胞变圆凋亡,几乎无正常成纤维细胞存在;其中45ug/ml 72h组细胞已完全裂解,呈现散在碎片。(图1 96孔板内不同浓度紫杉醇作用不同时间MTT反应后图片)

 2   MTT结果

       4.5ug/ml组24h、48h、72h的抑制率分别为43.68%、75.54%、95.13%;13.5ug/ml组24h、48h、72h的抑制率分别为58.84%、77.71%、97.11%;45ug/ml组24h、48h、72 h的抑制率分别为68.05%、91.88%、97.02%。

不同浓度下各组细胞的OD值与对照组相比降低,均有明显统计学意义(P<0.01)(表1)。4.5ug/ml组的48h、72h OD值与24h OD值相比均有明显统计学意义(P<0.01);13.5ug/ml组的48h OD值与24h OD值相比无统计学意义(P>0.05),72h OD值与24h OD值相比有明显统计学意义(P<0.01),;45ug/ml组48h、72h OD值与24h OD值相比有统计学意义(P<0.05)(表2)。同一浓度下,作用时间越长,抑制率越高。24h及48h内,药物浓度越高,抑制率越高;72h后,各浓度均达到较高抑制率(>95%)(表3)。

三、讨论

       各种原因(如腔内阻塞,外源性压迫,或气道软化等)导致的气管及支气管狭窄,可引发阻塞性肺炎、肺不张、呼吸困难等多种临床症状,严重者可发生呼吸衰竭,危及生命。以往对这些病人通常采取外科手术冶疗,处理较困难,且创伤大风险高。近年来,随着内窥镜技术、生物相容性材料及支架制作技术的发展,气道支架置入技术越来越成熟,也越来越受关注。通过支架植入,大部分气道狭窄的病人可以获益,症状能很快缓解。因此支架置入成为治疗气道狭窄,尤其是中心气道狭窄的重要手段之一。

       但气道支架植入过程中对气道粘膜的损伤及支架本身作为异物刺激而导致肉芽组织增生引发的管腔再狭窄,严重影响了支架植入后临床疗效。尽管硅酮及合金等材料的组织相容性再不断改进,但支架置入后仍有5%-35%(甚至更高)的患者气道粘膜受支架刺激而形成肉芽肿,使气道再狭窄2-4。故目前支架植入术后往往需要多次气管镜复查,对肉芽组织进行干预处理,包括微波热凝固、高频电凝、冷冻治疗及激光治疗等。反复操作不仅增加了病人的经济和心理负担,且临床效果并不满意,肉芽组织增生的再发生率可达10%-50%5

       故有学者考虑用局部用药来解决气道支架植入后再狭窄这一难题。动物实验6已证明局部应用化疗药物丝裂霉素C能够延长气道支架植入后的通畅时间,并且支架通畅的维持时间与丝裂霉素C的应用次数呈相关性。因此,实现支架局部的长时间缓释给药,在一定程度上能够解决支架植入后再狭窄的问题。

       冠脉药物洗脱支架为我们提供了一个方向。自上世界70年代经皮冠脉成形术引入来,其已经成为处理冠脉疾病的重要方法。但同气道支架植入后一样,冠脉成形术及冠脉支架放置后的再狭窄也曾是影响其临床长期疗效的瓶颈。但紫杉醇等冠脉药物洗脱支架的诞生,通过抑制细胞有丝分裂和内膜增生,极大提高了早期治疗效果并降低了再狭窄的风险,并且不影响损伤愈合和内皮化7,8。大量防止冠脉再狭窄的研究中,发现紫杉醇是能够通过洗脱支架达到治疗浓度且没有系统毒性风险的最佳药物,同时紫杉醇又是常用的抗肿瘤化疗药物,病人耐受良好8-10。因此,鉴于紫杉醇药物洗脱支架在心血管领域的卓越贡献,以及紫杉醇作为化疗药物在临床上的广泛应用,本实验选取紫杉醇作为目标药物,探讨其作为气道涂层支架备选药物的可行性。

       强生公司的Cypher缓释和速释的紫杉醇支架初始浓度分别为 1.02ug/mm2 (共85ug) 和2.04ug/mm2 (共171ug);波士顿公司的TAXUS的缓释紫杉醇支架的初始浓度为1.0ug/mm211,它们都已经大规模临床应用于心血管领域,证实安全有效。由于洗脱支架的药物浓度是按照支架面积计算的,相比而言,气道支架的直径、长度均远大于冠脉支架,其药物含量必定要更高,才能保证单位面积的药物分布。因为紫杉醇是一种相对安全的化疗药物,化疗用量为135-300mg/m2静脉滴注,远高于冠脉涂层支架所含的药量,所以,紫杉醇在药物剂量和浓度的选择方面,具有较大的空间。因此,参考冠脉涂层支架的药物浓度、化疗剂量以及紫杉醇的血峰浓度(PPC)1,本实验选取了1PPC(4.5ug/ml)、3PPC(13.5ug/ml)和10PPC(45ug/ml)三个浓度,其剂量远小于化疗剂量(135-300mg/m2),浓度也远低于紫杉醇药物的原液浓度(6mg/ml),而且如果采取药物涂层支架的缓释给药,局部作用能够减小系统毒性的风险,因此可以保证其安全性。

       试验结果示,1PPC、3PPC、10PPC紫杉醇作用HPF 72h后,抑制率分别为95.13%、97.11%、97.02%,均达到95%以上,并且镜下可以看到HPF出现明显的凋亡。因此,可以证明紫杉醇对人胚肺成纤维细胞具有抑制作用。

       支架植入后肉芽组织增生的病理生理学机制为损伤后炎症介质释放,损伤部位巨噬细胞大量聚集,成纤维细胞和毛细血管增生进行组织修复,其类似于瘢痕形成的过程5,12。抑制成纤维细胞的增殖可以抑制肉芽组织增生,这在眼科、整形外科等都进行过广泛研究13-15,并得到了肯定的结果。本实验证明紫杉醇能抑制HPF的增殖,因此理论上推断,紫杉醇在抑制气道肉芽组织增生方面可能具有潜在价值,可以作为气道药物涂层支架的备选药物,也许能在一定程度上缓解气道支架植入后瘢痕形成导致的再狭窄。

       由于紫杉醇药物洗脱支架在冠脉介入领域的广泛应用,其设计生产均已比较成熟,如果其能够用于气道介入领域,必定有广阔的发展前景。但由于本试验仅粗略观察了紫杉醇对成纤维细胞生长的影响,关于紫杉醇对活体支架植入后肉芽组织增生的作用效果仍不明确;另外,如果用于活体实验,紫杉醇的具体安全有效剂量和单位面积内应分布的药物浓度,还需进行详细的实验设计及进一步证实,动物试验及大样本的疗效观察是我们下一步将要进行的工作。

 参 考 文 献

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王婷、张杰  发表于《中华结核和呼吸杂志》2010年第33卷第1期

紫杉醇对人胚肺成纤维细胞增殖的抑制作用

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